腸道微生物叢

吳偉愷

前言

當代醫學的發展史中，19世紀是微生物醫學的黃金時代，科學家透過發現微生物、培養微生物並闡明其意義，奠定現今微生物學知識基礎。包括透過顯微鏡發現微生物的雷文霍克 (Antonie van Leeuwenhoek)、提出「柯霍式法則」建立微生物和疾病因果關係的柯霍 (Robert Koch) 以及闡明微生物意義、改良預防接種並發明巴氏消毒法的巴斯德 (Louis Pasteur)。早期研究微生物以致病菌為主，微生物學常被歸類在感染醫學的範疇，自佛萊明(Alexander Fleming) 20世紀發現盤尼西林後，近百年來人類發展出各種抗生素，治療感染症病患拯救許多性命。然而，在根除微生物的治療策略下，有時會忽略了微生物與宿主共存共榮的可能性。事實上，人體內共生的細菌多達數十兆，比人類本身的細胞數還多，而腸道菌所含有的基因總數，更是人類基因的100倍。因此，人類微生物叢 (human microbiota) 可說是貢獻了人類的第二基因體 (second genome)，甚至被視為一個過去被遺忘的重要「器官」。這些複雜的微生物叢包括細菌、黴菌與病毒，廣泛存在於人類的皮膚、呼吸道、腸道、泌尿道、生殖道等器官。自21世紀起，科學家發現在遍佈人體全身的微生物叢中，腸道菌叢 (gut microbiota) 與宿主的交互作用，可直接或間接地影響宿主的免疫、代謝與神經傳遞功能，而人體微生物叢 (human microbiota) 的相關研究，讓過去許多不明病因的人類慢性與退化性疾病，開啟了一條全新的解方尋求之路。

腸道菌對人體健康的影響

人體中95%以上的細菌，都存在於大約7米的消化道中。隨著氧氣濃度、酸鹼值、滲透壓、消化液與食糜型態等差異，從口腔到肛門，不同區段的消化道，常駐著不同細菌組成的共生菌 (commensal bacteria)。一般來說，上消化道的微生物叢，菌量與菌種數較少，以微需氧菌 (microaerobic bacteria) 和兼性厭氧菌 (facultative anaerobe) 為主，而常駐於下消化道的菌叢，菌量與菌種多樣性較高，所含的細菌種類有上千種，主要是以厭氧菌(anaerobic bacteria) 為主。這些多元又複雜的腸道微生物，自人類出生的那一刻，便開始進駐到身體裡面，隨著嬰兒成長過程與暴露的環境因子一同適應與演化。生命早期 (early life) 的腸道菌叢很容易受到環境因子的干擾而影響菌叢的發展，包括自然產或剖腹產、母乳或配方奶、副食品介入的時間、疾病狀態和抗生素使用等。一般來說大約三歲之後，人體便建立腸道菌叢的基本雛形，之後隨著年紀增長、生活型態與暴露環境的變化，菌叢的組成與功能還會有所改變，並且持續影響健康與疾病狀態。腸道菌對人體健康與疾病的影響，主要可以分成四個面向討論，分別為免疫、代謝、腸腦軸 (gut-brain axis) 與腸道屏障 (gut barrier)。

免疫系統

免疫系統是生物體所建立的防禦機制，主要針對體內的異常物質進行排斥反應，包括各種微生物、寄生蟲、過敏原與腫瘤細胞等，目的為抵禦外來物質對生物體所產生的危害。若將人體比喻成一座城市，免疫系統就像明察秋毫的司法體系，對付壞人同時也保護好人， 如幼年時期開始面對各種環境刺激的訓練，教導免疫系統辨認敵我，一方面對病原進行清除反應 (immune clearance)，控制感染與腫瘤疾病，一方面與和平共存的環境抗原 (如共生微生物、過敏原) 建立免疫容忍性 (immune tolerance)，避免產生過度反應導致過敏與自體免疫疾病。

腸道微生物叢存在於表面積高達兩座網球場大的消化道粘膜上，與粘膜下腸淋巴組織 (gut-associated lymphoid tissue, GALT) 近在咫尺，是訓練人體免疫防禦系統的重要場域。腸道菌叢是否能維持良好狀態，影響宿主的免疫系統的正常發展，攸關免疫系統對抗感染與腫瘤疾病的能力，也可能影響自體免疫疾病的發生。近年美國國衛院研究人員發現，相對於實驗鼠，野鼠的腸道菌能刺激宿主產生較佳的免疫力以對抗流感病毒與大腸腫瘤。台大研究團隊也在動物實驗發現，腸道菌組成對於免疫調控的機制，會影響宿主清除B肝病毒的能力，是B肝病毒急性感染後是否成為帶原者的重要因素。日本慶應大學Kenya Honda團隊更近一步證實，Th1輔助細胞、Th17輔助細胞、調節T細胞 (Treg) 與細胞毒性T細胞 (cytotoxic T cell) 等後天免應系統 (adaptive immunity) 的成熟與特定腸道菌叢的刺激有關，並發現相關機制能影響發炎性腸炎 (inflammatory bowel disease) 的嚴重度以及免疫系統對抗腫瘤的能力，甚至影響免疫療法 (immunotherapy) 治療癌症的效果。然而，由於腸道菌組成與免疫細胞的交互作用相當複雜，人體各種免疫細胞成熟與分化過程中，腸道微生物叢所扮演的調控角色仍未完全清楚，未來若能闡明其中關鍵的分子機制，將可為免疫治療方法帶來新的契機。

代謝系統

人體的代謝系統是維持生命正常運作的生化反應集合，涵蓋各種分解與合成的有機反應、能量使用和儲存方式，及代謝過程所產生的化學分子，在體內所產生的生物反應、利用與解毒過程。如果將免疫系統比喻作司法體系，那麼代謝系統則像金融體系，掌管能量儲存與消耗。一般來說，人體的代謝能力會隨著生命週期有所變化，嬰兒、青少年、成年、老年與孕期的代謝能力皆有所差異，主要是受荷爾蒙的調控以應對發育與環境適應需求。即使處於相同的生命階段，不同個體的代謝能力仍具明顯差異。近年不少研究顯示，代謝體質的差異可能來自腸道微生物叢與其代謝物對宿主的調節作用，並可能是導致肥胖、糖尿病、心血管疾病、脂肪肝等疾病的重要因素(圖一)。

腸道菌研究之父，美國聖路易斯華盛頓大學Jeffrey Gordon率先發現，在相同基因背景與飲食的狀態下，腸道菌為肥胖與營養不良的重要病因。而腸道菌代謝膳食纖維所產生的短鏈脂肪酸 (short chain fatty acids, SCFAs) 對宿主細胞G-protein coupled receptor 41與G-protein coupled receptor 43的作用，以及膽酸與farnesoid X receptor和Takeda G-protein coupled receptor 作用所產生的下游訊號，已被證實是腸道菌調節宿主能量消耗與脂肪形成的重要途徑。相關研究說明了臨床上具有相同基因背景的病患，可有不同的代謝表徵，甚至相似飲食習慣的人，也會有易胖與易瘦體質的差異。

除了短鏈脂肪酸與膽酸之外，腸道菌也會利用飲食中許多蛋白質與脂質相關的營養素，產生各種具有生物活性的化學產物，調控宿主的生理代謝功能。比如說腸道厭氧菌能利用食物中未消化的膽鹼 (choline) 與肉鹼(carnitine) 產生三甲胺 (trimethylamine, TMA)，進入肝臟被黃素單氧化酶 (flavin monooxygenase, FMO) 作用，在人體內形成氧化三甲胺 (trimethylamine N-oxide, TMAO)，進入循環系統後由腎臟排出。氧化三甲胺目前已證實是導致粥狀動脈硬化與血管栓塞的獨立因子，對心血管疾病所帶來的風險存在劑量依賴效應，可望成為未來監測心血管疾病的重要標的。此外，部分必須透過腸道菌才能產生的小分子代謝物，陸續被發現其潛在影響宿主血糖與脂肪代謝的生物活性，如吲哚衍伸物 (indole derivatives)、咪唑-4-酮-5-丙酸 (imidazole propionate)、苯乙酸(phenylacetic acid) 等，分別為色氨酸 (tryptophan)、組氨酸 (histidine) 與苯丙氨酸(phenylalanine) 的腸道菌代謝產物 (表一)。然而，由於目前相關的微生物代謝途徑仍未完全明朗，究竟是哪些關鍵菌種扮演影響宿主生理機制的重要角色，以及相關基因產物導致疾病相關的代謝反應，未來仍需進一步釐清。

圖一 腸道菌代謝產物由腸腔進入體循環 (Gut-systemic axis) 調控全身病生理狀態。(adapted from Wu WK et al. Rapid Commun Mass Spectrom 2020)

表一 目前已知具生物活性之小分子腸道代謝物 (adapted from Wu WK et al. Rapid Commun Mass Spectrom 2020)

腸-菌叢-腦軸線 (gut-microbiota-brain axis)

除了調節人體的免疫與代謝功能外，腸道微生物叢也能影響中樞神經系統 (central nervous system, CNS) 功能，包括發育性 (如自閉症)、退化性 (如帕金森氏症、阿茲海默症)、發炎性 (如癲癇) 與情感性 (如焦慮症、憂鬱症) 神經疾病，甚至食慾與攝食等行為表現，都被發現與腸道菌的組成與功能有關，且因果關係與部分機制已被研究證實。事實上，人體的腸神經系統 (enteric nervous system, ENS) 擁有神經元數目與網絡複雜度僅次於大腦，除了透過迷走神經 (vagus nerve) 與大腦進行訊息溝通外，也能透過腸道內分泌細胞 (enteroendocrine cells) 所分泌的神經傳導物質 (neurotransmitters) 獨立作業，故ENS有第二個大腦之稱。流病研究發現，部分退化性神經疾病與精神疾患，如帕金森氏症、阿茲海默症與焦慮症，常伴隨有慢性便秘與腹瀉等腸道相關共病症，支持腸道與大腦之間的緊密連結關係。目前科學界普遍認為，在腸-菌叢-腦軸線 (gut-microbiota-brain axis) 中，腸道與大腦溝通主要透過兩條途徑：一條是來自腸道菌代謝物、腸道神經性賀爾蒙、腸道粘膜下免疫反應與ENS交互作用所產生的下游訊號，透過迷走神經與大腦進行訊息回饋。另一條則是腸道菌代謝物與神經傳遞物質進入血液循環系統，通過血腦屏障 (blood brain barrier) 進入中樞神經系統與腦細胞進行作用。如人體內超過 90% 的血清素(serotonin, 5HT)，是由腸道類腸嗜鉻細胞 (enterochromaffin-like cell, ECC) 代謝食物的色氨酸所形成，透過迷走神經與大腦進行訊息傳遞，而近期研究發現，ECC分泌血清素的功能需仰賴腸道菌的刺激，顯示腸道菌叢在腸腦軸(gut-brain axis) 所扮演的調控角色。此外，人體腸道菌叢本身亦能在腸腔內製造多種神經傳導物質，包括多巴胺(dopamine)、 γ-aminobutyric acid (GABA)、血清素 (serotonin)、正腎上腺素(norepinephrine) 等，然而這些物質是否能有效傳遞至ENS與CNS並發揮作用仍有待進一步研究證實。總結來說，大腦與腸道兩種器官雖在解剖位置上天差地遠，但兩者之間確實存在密不可分的關係，而腸道微生物叢在腸道與大腦的溝通聯繫中，扮演舉足輕重的角色。腸道對大腦來說，有如運籌帷幄之中，決勝千里之外，未來若能闡明更多腸-菌叢-腦軸線的病生理機制，將可望達到腦病腸治的目標。

腸道屏障 (gut barrier)

雖然腸道微生物叢在人體內扮演許多重要的生理調控角色，但環境中仍有許多不速之客，須小心控管，腸道上皮組織發展出特殊的粘膜屏障系統，針對這群常駐體內、數以兆計的微生物進行適當的區隔與管理，有如國土邊境安全管制，防堵病原菌進入體內。粘膜屏障系統包括杯狀細胞 (goblet cell) 分泌的黏液層 (mucus layer) 與腸上皮細胞之間的緊密聯接蛋白 (tight junction protein) 物理性隔離，腸上皮細胞分泌的抗菌胜肽 (antimicrobial peptides, AMPs) 與固有層 (laminar propria) B細胞產生的IgA，進入腸腔以阻止病原菌增生，加上駐守在粘膜下培式斑塊(Peyer’s patch)的先天與後天免疫細胞部隊，共同形成多道防線來進行邊境控管，防止病原菌伺機入侵體內。然而，一但腸道屏障受到破壞，病原菌可能入侵體內導致感染，細菌的結構分子或外分泌物質，如脂多醣 (lipopolysaccharide, LPS)、肽聚糖 (peptidoglycan)、鞭毛蛋白 (flagellin)、外分泌蛋白酶 (extracellular proteases) 與細菌DNA等，也會進入體內造成代謝型內毒素血症 (metabolic endotoxemia) 誘發免疫反應，促使慢性發炎與代謝異常。腸道屏障的完整性是否健全，取決於腸道微生物叢與宿主腸粘膜屏障系統的平衡，這也是影響許多慢性病發生的重要因素之一。目前腸漏 (leaky gut) 所代表的分子機制與病生理意義還不夠明確，未來若能進一步證實腸道屏障在慢性發炎性疾病的臨床意義，將有助於發展新的治療與預防方法。

腸道菌的臨床應用面向

人類疾病的發生主要是因為先天不足，後天失調。先天不足是由於宿主基因的變異與缺陷，後天失調則是受到不良生活型態與暴露不良環境的影響，包括飲食習慣、生活作息與環境污染等。事實上，腸道微生物叢亦是影響病生理的重要環境因子，其依附於消化系統內，附著在腸道粘膜上，是影響人體健康與疾病的因子中，最親密，也最具活性的因素。過去精準醫療的發展主要著眼於人類基因的變異與表達，然而人體本身的基因卻無法解釋所有疾病的走向。要達到全面的個人化醫療，必須同時考慮廣泛影響病生理機制的腸道微生物叢，若忽略人體內微生物基因的重要性，精準醫學可能會變成不精準醫學。過去十年，腸道微生物叢的研究處於探索階段，主要是建立腸道微生物與許多疾病的關聯性，未來腸道微生物叢的研究將會朝臨床應用的方向加速邁進，其中主要包含兩個面向：疾病的預測、診斷與預後評估，以及預防與治療的輔助。

疾病預測、診斷與預後

近年已有不少研究從腸道微生物相的序列資料中，找出與疾病具相關性之腸道菌叢特徵，並依據這些特徵建立疾病預測模型，如以色列魏茨曼研究院收集健康人的血液生化、飲食數據、身體活動、與腸道微生物相等大數據資料，透過資料分析，了解各種與血糖反應具有關聯性的腸道菌種與微生物基因，挑選出具代表性的微菌特徵，利用機器學習演算法，建立能準確預測人體對各種食物所產生的血糖反應模型，並依此提供個人化營養菜單，有效控制血糖。台大研究團隊近年也開發了口服肉鹼耐量試驗 (oral carnitine challenge test)，透過此試驗成功辨別不同個體腸道菌代謝肉鹼生成TMAO的差異，建立人體TMAO產能的預測模型，並找出腸道生成氧化三甲胺的關鍵菌種。其他包括大腸癌、發炎性腸炎、肝硬化、非酒精性脂肪肝，甚至類風濕性關節炎等疾病，都已證實腸道微生物叢與代謝物可當作疾病的生物特徵(biological features)，建立微菌輔助診斷與預測的模型。腸道微生物叢亦能對口服藥物進行代謝與修飾，除影響生物利用率 (bioavailability)，也改變了原本效用和毒性，因而有微生物藥物體學 (pharmacomicrobiomics) 的研究分支。此外，腸道菌叢的個體差異，亦可用來推估發炎性腸炎病患接受生物製劑治療的預後，甚至是預測癌症病人接受免疫療法的治療反應，未來若成功經由不同人種、族群的臨床驗證，將有機會作為精準醫療的輔助應用。

疾病預防與治療輔助

糞菌移植 (fecal microbiota transplantation, FMT)

透過調整腸道微生物叢的組成與功能，改變人類治療與預防疾病的方法，是腸道菌研究的終極目標。近年來因發現糞菌移植 (FMT) 能有效治療難治型困難梭狀桿菌感染 (refractory Clostridium difficile infection, rCDI)，興起一股FMT熱潮，不過截至目前為止，雖然發現FMT對CDI有高達9成的效果，但對潰瘍性結腸炎 (ulcerative colitis, UC) 僅增加20-30%的治療反應，其他慢性疾病則尚無明顯證據支持FMT的臨床療效。事實上，FMT成功治療CDI的理論基礎，是將具高多樣性腸道菌叢的健康人糞便，植入多樣性低且以困難梭狀桿菌為主的CDI病患腸道，讓植入的多樣性的腸道菌叢在病患腸道中發揮以夷制夷的角色，達到治療疾病的效果。然而這樣的假說似乎過度簡化了腸道微菌與宿主的交互作用，因此在CDI以外的疾病，FMT並無法發揮太大的臨床效果。此外，FMT的標準化與安全性問題仍未完全解決，雖然目前已有篩檢方法可排除帶有病原菌的FMT捐贈者，但FMT仍存有抗藥性基因水平轉移與長期未知不良反應的安全性問題。此外，FMT供者的糞便檢體品質也會隨著飲食習慣、生活習性與健康狀態而隨時變化，即使排除安全性問題，也無法像藥物一樣進行嚴格的標準化管控。因此，作為一項潛在微菌治療方法，FMT應扮演橋接的角色，如近期研究發現FMT改善了原先對免疫療法反應不佳的黑色素瘤患者治療效果，提供了一個概念驗證 (proof of concept) 證據，然而，最終仍需找到改善疾病表型的關鍵腸道菌種或菌群，甚至是微菌代謝物，才能建立真正有效且穩定的微菌治療。

益生菌與益生質 (probiotics & prebiotics)

益生菌的基本定義為，在食入適當劑量下，對宿主產生健康效益的活性微生物。目前坊間所販售的益生菌以乳酸菌 (lactic acid bacteria) 為主，主要為雙歧桿菌屬 (Bifidobacterium spp.) 和乳桿菌屬 (Lactobacillus spp.)，是源自20世紀初俄國微生物學家梅契尼可夫 (Metchnikoff) 提出發酵乳中乳酸菌對人體健康有益論。不過目前市售的益生菌大多僅有體外 (in vitro) 或動物實驗的結果，較缺乏臨床試驗的證據，甚至有些益生菌沒有明確的菌株資訊。過去傳統益生菌臨床實證較薄弱的原因，一方面是因為人體本身的腸道菌種數相當龐大，外來的益生菌不易在通過胃酸、膽鹽等消化液後，還順利留在腸內定植，一方面則是因為人體對益生菌反應的個體變異性大，不易在小規模臨床研究中看到療效。也因為傳統益生菌臨床療效常不夠明確，因此傳統益生菌主要歸類在健康食品，尚未納入醫療處方。然而，近年由於腸道微菌研究的進步，許多具高度活性、可調控發炎與改善代謝的重要厭氧菌被發現，如有名的Akkermansia muciniphila，被發現可以幫助減肥、改善血糖控制與強化腸道屏障的功能，是一株相當具潛力的明星菌種，有機會成為新一代益生菌。目前A. muciniphila在美國已有FDA核可的產品上市，不過仍需觀察中長期的安全性，未來可能會走新藥途徑，以live biotherapeutic product (LBP) 的形式進行審查。除了活菌之外，益生菌菌體本身結構的活性成分或是其所製造分泌出來的活性物質與代謝產物，科學家稱其為後生元(postbiotics)，也是開發微菌新藥的標的，如近年以色列Patrice Cani團隊發現A. muciniphila的Amuc_1100膜蛋白可增強腸道屏障、改善血糖控制，以及首爾大學團隊發現A. muciniphila可分泌促使腸道L細胞生成GLP-1的P9蛋白，都是開發微菌新藥的候選分子。另外，許多益生菌產品會加入益生質，如菊糖 (inulin) 和果寡糖(fructooligosaccharides, FOS) 等膳食纖維成分，除了可以作為幫助益生菌生長的養分外，也可作為益生菌生成短鏈脂肪酸的原料。

抗生素 (antibiotics)

距離1928年佛萊明發明盤尼西林至今一百年間，許多抗生素已被開發出來，特別是廣譜型抗生素，因可涵蓋大部分病原菌在臨床上廣為使用，不過也衍生了CDI與抗生素相關腹瀉 (antibiotics-associated diarrhea) 等問題。近年來，已有口服吸收率低，主要作用於腸道微生物的抗生素，被用來治療非感染性疾病，如rifaximin可用來治療肝腦病變與腸躁症，甚至是發炎性腸炎。新一代的窄譜抗生素如fidaxomicin，對困難梭狀桿菌具有專一抑制效果，對整體腸道菌相破壞性小，改善了CDI治療後的復發率。由於越來越多的腸道菌被發現與代謝繁亂、慢性發炎、甚至癌症有關，未來可能會出現更多針對特定有害菌而設計的窄譜型抗生素，作為治療非感染性疾病的方式。

腸道微生物叢研究工具

科學家發現腸道菌相與人類疾病的相關性，除了有助於發展新的疾病診斷與預後工具，亦提供探討致病機轉一個新的思考與切入方向，包括透過改變微生物叢作為新的疾病治療手段。然而，腸道菌叢的變化會受到宿主本身的基因以及所處的環境、飲食、作息和疾病狀態所影響，腸道菌與疾病的關聯性包含許多複雜變因的集合，僅透過相關性研究並無法釐清腸道菌與疾病的因果關係。因此，腸道微生物叢與人類疾病的相關性研究，僅是腸道微生物叢研究的開端，仍需使用其他研究工具來建立腸道菌與疾病的因果性和相關機制，才有助於轉譯醫學後續的應用發展 (圖二)。

圖二 腸道微生物叢轉譯醫學研究方法與模式工具。(a) 以病例—對照研究找出疾病相關腸道菌種與代謝物。 (b) 利用糞菌移植建立人源化腸道菌鼠，探討腸道菌與疾病的因果性。(modified from Wu WK et al. Rapid Commun Mass Spectrom 2020)

微生物總體基因體學 (microbial metagenomics)

隨著基因定序技術的進步，在人類後基因體時代，腸道微生物體學也跟著蓬勃發展，許多慢性疾病被發現與特定的腸道微生物叢組成或功能性基因具高度相關性，如心血管疾病、糖尿病、肥胖、脂肪肝、發炎性腸炎、類風濕性關節炎、阿茲海默症、帕金森氏症、自閉症等。目前常見的高通量定序設備包括短讀長的Illumina平台與長讀長的PacBio、Nanopore平台，且由於儀器與試劑的進步，定序成本大幅降低，不過大量序列資料仍需仰賴生物資訊專家對數據資料進行良好的品質管控、分類、優化與統計分析。目前國內生物資訊人才仍相當缺乏，因應生物資訊處理的龐大人力需求，坊間有業者推出操作介面較容易上手的軟體，亦可作為研究者自行初步分析使用的工具之一。

微生物代謝體學 (microbial metabolomics)

由於腸道菌種組成、微生物基因豐度與疾病的關聯性中，DNA無法代表具功能性的RNA與蛋白質表現與轉譯後修飾，距離利用微生物基因解釋人類疾病機轉仍有一段不小的距離，加上許多腸道厭氧菌不易培養，基因資料庫較不完整，不少基因產物的功能尚未被驗證，使得基因和疾病關聯性容易出現解釋意義偏差，因此直接針對腸道菌代謝物進行檢測分析，便成為一個直接探討腸道菌功能性的解決方案之一。近幾年科學家發現許多具生物活性且能調節宿主生理的腸道菌代謝物，包括TMAO, imidazole propionate, phenylacetate, indole propionate等，皆是使用高解析質譜進行代謝體分析並與疾病進行對照，找出與疾病相關之候選代謝物，再進行體外與動物實驗驗證。因此，針對具功能性小分子，代謝體分析提供探勘腸道菌活性分子較為直接的研究平台，有助於加速腸道菌小分子新藥的開發。

無菌鼠與微菌定植鼠模型 (germ-free mice and gnotobiotic mice model)

無菌動物的觀念最早於 1885 年由 Louis Pasteur 提出，一直到 1946 年才由 Reynier 成功培育出第一批無菌鼠。早期無菌鼠飼養在笨重昂貴的不鏽鋼隔離操作箱 (stainless steel isolator)，後來逐漸被較輕盈易觀察的透明塑膠材質所取代。飼養無菌鼠的每顆隔離操作箱 (isolator) 都有獨立的氣流過濾系統，且有特殊的運輸裝置和滅菌程序。雖然無菌鼠模型已經有一段時間的發展史，但由於其繁殖、飼育、操作與品管流程繁複且不易簡化，因此無菌鼠設施的設置與維護仍需要耗費相當的人力與技術成本。找出腸道微菌與疾病的相關性後，若要進一步探討腸道菌對疾病發生或治療預後的影響，需使用合適的動物實驗模式來進行因果性的驗證。其中，無菌鼠 (germ-free mice) 與微菌定植鼠 (gnotobiotic mice) 模型，便是驗證微菌與疾病因果性的黃金標準。除了可比較在有菌與無菌的狀態下，宿主的表型或基因表達是否受到腸道菌影響，亦可將特定菌株 (mono-colonization) 或特定菌群(consortia colonization) 定殖於無菌鼠來研究微菌與宿主的交互作用、因果關係和分子機制，對於揭開腸道菌如何調控宿主免疫、代謝與神經功能的機制，或是菌相失調致使人類疾病發生的脈絡，都能獲得更深入的探討。在轉譯醫學應用方面，亦可將不同疾病表型的人類糞便移植至無菌鼠腸道中，建立人源化腸道菌鼠 (humanized gnotobiotic mice or human microbiota associated mice) 模型，來驗證臨床微菌基因體定序分析觀察到的結果，是否存在微菌與疾病表型的因果性。

厭氧菌培養體學 (anaerobic culturomics)

人類腸道微菌研究發展至今，已無法滿足於菌相與疾病相關性的發現，即使透過菌相基因體定序分析找到可能導致或保護疾病的特定菌種，仍需將目標菌種進行體外與動物實驗以驗證研究假說，唯有將目標菌株分離培養出來，才可針對特定菌種進行更明確的致病機制探討。由於人類腸道是無氧環境，絕大多數腸道中的細菌屬於厭氧菌，甚至是對氧氣極為敏感的絕對厭氧菌，一旦接觸到外在空氣很快就失去活性，無法進行活化培養。此外，由於人類腸道微菌種類與數量繁多，每公克的糞便中，細菌數量高達1011~1012，種類高達上千種，部分相對豐度比例較低的菌種 (relative abundance ≈ 0.01%)，即使能進行體外培養，也很難在培養基上從成千上萬個菌株中挑選分離出來。因此，厭氧菌培養一直是過去研究腸道菌的難題。不過，近年來隨著厭氧培養與菌種鑑定方法的進步，加上人類微生物基因體資料庫的建立，許多過去認為無法培養的腸道菌逐漸被培養、分離與鑑定出來，特別是法國馬賽大學Didier Raoult所率領的微生物培養體團隊，利用多元的培養條件，搭配自建MALDI-TOF資料庫快速菌種鑑定方法，僅花費數年的時間，就將過去大多數已知的腸道微菌培養出來，並進一步分離培養出超過500株人體腸道新菌種。這項創舉為過去窒礙難行的腸道菌厭氧培養開啟一道曙光，預期未來將會有更多與人類疾病相關的重要微菌被發現、培養並闡明意義，為人類的精準醫療開創嶄新的契機。

結論

腸道微生物叢是近年興起的生物醫學領域，與人工智慧同樣被認為具有為現代醫療帶來巨大變革的潛力，目前相關研究正處於快速發展的萌芽階段，雖然在臨床應用尚未完全開花結果，卻已帶來許多嶄新的思維突破。未來腸道微菌的發展，將從關聯性的發現走向因果性的研究，最終回歸培養探討微菌與宿主的作用機制，為精準醫療的目標放上最後一塊拼圖。

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27. 吳偉愷等：無菌鼠模型在腸道菌研究之應用。台灣消化系醫學會第四十四屆教育研討會講義 July 1 2017。